荧光定量PCR技术产生并成熟于上世纪90年代，由于该技术实现了PCR从定性到定量的飞跃，能够对PCR反应的全过程进行实时监控，并且自动化程度高，所以该技术从产生到现在短短的十几年时间，在科研及检验领域获得了广泛的应用，成为分子生物学领域不可或缺的一项重要技术。

荧光定量PCR是实验室最常用的实验，荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号随着PCR反应的积累来实时监控PCR反应的进程，并通过分析软件对PCR的反应进行球盟会官网入口分析的技术。

 荧光定量PCR应用领域 

临床疾病诊断：各型肝炎、禽流感、结核、性病等传染病诊断和疗效评价；地中海贫血、血友病、性别发育异常、智力低下综合症、胎儿畸形等优生优育球盟会官网入口；肿瘤标志物及瘤基因球盟会官网入口实现肿瘤病诊断；遗传基因球盟会官网入口实现遗传病诊断。

动物疾病球盟会官网入口：禽流感、新城疫、口蹄疫、猪瘟、沙门菌、大肠埃希菌、胸膜肺炎放线杆菌、寄生虫病等、炭疽芽孢杆菌。

食品安全：食源微生物、食品过敏源、转基因、乳品企业阪崎肠杆菌等球盟会官网入口。

科学研究：医学、农牧、生物相关分子生物学定量研究。

应用行业：各级各类医疗机构、大学及研究所、CDC、检验检疫局、兽医站、食品企业及乳品厂等。

 常见荧光定量PCR方法比较 

SYBR Green I 球盟会官网入口模式

SYBR Green I 的优点：SYBR Green I 的优点是因为其缺点产生，由于它能所有的双链DNA相结合，所以对不同模板不需特别定制不同的特异性探针，通用性较好，并且价格相对较低。这对科研是很有利的，因此国内外在科研中使用比较普遍。

水解探针模式(Taqman探针)

TaqMan 探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的 5’末端， 而淬灭剂则在 3’末端。当探针与靶序列配对时，荧光基团发射的荧光因与 3’端的淬灭剂接近而被淬灭。在进行延伸反应时，聚合酶的 5’外切酶活性将探针切断，使得荧光基团与淬灭剂分离，发射荧光。

杂交探针模式(Beacon、FRET)

分子信标是一种呈发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，因此标记在一端的荧光基团与标记在另一端的淬灭基团紧紧靠近。荧光基团被激发后产生的光子被淬灭剂淬灭，由荧光基团产生的能量以红外而不是可见光形式释放出来。

能用于实时荧光 PCR 定量的方法很多，各有优缺点，应根据实验的需要和当前的实验条件选择适合自己的方法。

 实时荧光定量PCR实验操作注意事项 

① 应该带一次性乳胶手套并经常更换，在试剂准备室和样本处理室应该配备负压式生物安全柜，以防止对环境或对样品的污染。

② 要严格防止气溶胶交叉污染。采取的措施有：使用一次性带滤芯移液枪吸头；不使用吸头吹打液体进行混匀;在生物安全柜中进行离心操作；尽量减少在生物安全柜以外开启试剂或PCR管；禁止在荧光定量PCR结束后打开PCR管盖。

③ 实验中牵涉的有毒有害及有污染的样本及试剂应该严格按照生物安全相关规定操作和处理。

④ 荧光探针应该避光保存，加入反应液后应尽快上机，以防探针粹灭。

⑤ 在进行RNA相关操作时，必须使用无RNase的实验器具及耗材，并加样后立即上机操作，以防RNA的降解。

⑥ 所有试剂在开启之前都要瞬时离心；试剂配制完成后要瞬时离心以去除气泡。

⑦ 不要在荧光定量PCR管上做任何标记，不能用手接触PCR管盖上采光部位。

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